文章来源:中华消化杂志,,39(3)
作者:董丽娜,王慕,张芳,等
摘要
目的
分析腹泻型IBS患者肠道清洁后的结肠灌洗液(以下简称肠液)的优势菌群特点。
方法
纳入年8月至年3医院消化科就诊的39例腹泻型IBS患者，另纳入医院消化科门诊自述偶有腹部不适或腹痛的排除IBS诊断的39例患者作为对照组。收集两组患者的结肠黏膜组织和肠液标本，提取组织及肠液的DNA，采用实时荧光定量PCR法检测普氏杆菌、拟杆菌门、梭菌属、双歧杆菌属、害肺戴阿里斯特杆菌、肠致病性大肠埃希菌、普拉梭菌、厚壁菌门、乳杆菌属和沙门菌10种优势菌。统计学方法采用t检验和Spearman相关性分析。
结果
腹泻型IBS组患者肠液和降结肠黏膜中的普氏杆菌菌群数分别为3.±1.和4.±0.，分别少于对照患者的4.±1.和5.±0.，差异均有统计学意义(t＝6.、12.，P均0.01)；拟杆菌门菌群数分别为3.±0.和3.±0.，分别少于对照患者的4.±0.和4.±0.，差异均有统计学意义(t＝6.、6.，P均0.01)；梭菌属菌群数分别为5.±0.和4.±0.，分别少于对照患者的5.±0.和4.±0.，差异均有统计学意义(t＝5.，P0.01；t＝3.，P＝0.)。腹泻型IBS组患者肠液中普拉梭菌菌群数为2.±1.，少于对照组的3.±1.，差异有统计学意义(t＝2.，P＝0.)。结肠黏膜组织与肠液中的厚壁菌门(r＝0.，P＝0.)、乳杆菌属(r＝0.，P＝0.)、双歧杆菌属(r＝0.，P＝0.)、普拉梭菌(r＝0.，P＝0.)均呈正相关，沙门菌(r＝－0.，P＝0.)、肠致病性大肠埃希菌(r＝－0.，P＝0.)均呈负相关。
结论
腹泻型IBS患者肠液菌群失调，普氏杆菌、拟杆菌、梭菌属和普拉梭菌菌群数均明显减少。
IBS是消化科常见的功能性肠病之一，我国以腹泻型IBS为主[1]。研究显示，肠道菌群失调与IBS密切相关，故肠道菌群成为治疗IBS的新靶点[2]。本课题组前期研究发现，结肠粪便菌群与黏膜菌群有不同特点，黏膜菌群与结肠功能关系更为密切[3]，但获取黏膜菌群是一种有创的取材方式。研究显示，肠道清洁后的结肠灌洗液(以下简称肠液)可替代黏膜组织用于研究肠道菌群[4]。目前，腹泻型IBS患者的肠液菌群是否改变，与黏膜菌群是否一致，尚鲜见研究。本研究采用实时荧光定量PCR法检测腹泻型IBS患者和对照患者黏膜高通量测序中的优势菌群，分析腹泻型IBS患者肠液菌群的特点，并与黏膜菌群进行比较。
对象与方法一、病例来源
纳入年8月至年3医院消化科就诊的39例腹泻型IBS患者。纳入标准：符合罗马Ⅲ诊断标准[5]，年龄范围为18～65岁，纳入本研究前3个月内未食用过酸奶或含益生菌、益生元等的保健品。排除标准：已知的肠道疾病，如免疫性肠病、腹部粘连、肛门或小肠瘘等；患有某些基础疾病，如糖尿病、高血压、肥胖症，或其他慢性病、癌症、妊娠、甲状腺功能低下等；有腹部手术史，如结肠切除吻合术和直肠切除造瘘术等，不包括胆囊切除术和阑尾切除术；纳入本研究前3个月内曾使用过抗菌药物。另纳入医院消化科门诊自述偶有腹部不适或腹痛的排除IBS诊断的39例患者，作为对照组。所有纳入患者在进行结肠镜检查前均采用酚酞片和甘露醇清洁灌肠；在行结肠镜检查时，采用活检钳取2块降结肠组织，将组织取样器内芯抽掉后插入肠镜，收集黏膜同部位的肠液标本4mL，置于－80℃冰箱保存。本研医院伦理委员会审核批准[()省医伦审字9号]，所有纳入患者均签署知情同意书。
二、肠液和结肠组织DNA的提取
采用QIAampDNA粪便DNA提取试剂盒，按照使用说明提取肠液的总DNA；采用QIAampDNA试剂盒，按照其使用说明提取各黏膜组织样本的总DNA；置于－20℃冰箱备用。
三、实时荧光定量PCR法的检测
实时荧光定量PCR法较高通量测序更为精确，选取10种在黏膜高通量测序中的优势菌进行实时荧光定量PCR法检测。采用伯乐iQSYBRGreenSupermixMaximaSYBRGreen实时荧光定量PCRMM试剂盒，在实时荧光定量PCR仪上扩增。引物序列见表1。采用20μL反应体系，预混物10μL，4μmol/L的正反向引物各1μL，DNA模板(肠黏膜组织1μL，肠液标本4μL)，以及H2O，加入实时荧光定量PCR管。细菌扩增条件：95℃10min，95℃15s，55℃1min，循环39次。各样本均重复2次。高阳性标本的PCR产物纯化后进行梯度稀释(1×～1×1拷贝)，制作标准曲线，根据样品Ct值及标准曲线，参照文献[6]的方法计算得出菌群拷贝数的对数值。
四、统计学分析
采用SPSS17.0软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；呈偏态分布的计量资料以中位数(下四分位数，上四分位数)表示，两组间比较采用秩和检验。相关性分析采用Spearman相关性分析。P0.05为差异有统计学意义。
结果一、一般资料
39例腹泻型IBS患者中，男17例，女22例，年龄范围为20～60岁，年龄为(39.6±11.3)岁；病程为7个月至6年。39例对照患者中，男10例，女29例；年龄范围为22～59岁，年龄为(40.0±9.5)岁。腹泻型IBS组和对照组的性别构成比、年龄差异均无统计学意义(P均0.05)，具有可比性。
二、腹泻型IBS组与对照组患者肠液菌群和降结肠黏膜菌群检测结果比较
所有纳入患者肠液菌群与降结肠黏膜组织菌群组成相似，菌群变化特点基本一致。见表2，腹泻型IBS组患者肠液和降结肠黏膜中的普氏杆菌、拟杆菌门、梭菌属菌群数均少于对照组，差异均有统计学意义(P均0.01)；腹泻型IBS组患者肠液中普拉梭菌菌群数少于对照组，差异有统计学意义(P0.05)；两组肠液和降结肠黏膜中的双歧杆菌、害肺戴阿里斯特杆菌、肠致病性大肠埃希菌、厚壁菌门、乳杆菌属和沙门菌菌群数差异均无统计学意义(P均0.05)；两组降结肠黏膜中的普拉梭菌菌群数差异无统计学意义(P0.05)。
三、优势菌之间的相关性分析
所有纳入患者标本菌株间的相关性分析显示，结肠黏膜组织与肠液中的厚壁菌门(r＝0.，P＝0.)、乳杆菌属(r＝0.，P＝0.)、双歧杆菌属(r＝0.，P＝0.)、普拉梭菌(r＝0.，P＝0.)均呈正相关，沙门菌(r＝－0.，P＝0.)、肠致病性大肠埃希菌(r＝－0.，P＝0.)均呈负相关，其他菌群未见相关性。
讨论肠道菌群被称为是人体的"体外器官"，而且肠道微生态失衡与肠内外多种疾病相关[7,8]。肠道菌群的标本来源有粪便、黏膜、结肠拭子等。粪便菌群不能替代黏膜菌群，而黏膜菌群与肠道功能关系更为密切[3,9]。粪便标本虽然易于采集，但是其为终产物，不能体现肠道局部特点；另外，粪便标本不能代表黏膜标本，而黏膜标本的获取为有创性，肠镜取材受限。Watt等[4]应用高通量测序法检测肠液的DNA，发现能用于测序且与黏膜标本一致。近年来，分子生物学技术的发展推动了肠道菌群的研究。高通量测序能检测更多的微生物群落，但是费用高、耗时长，且对属水平检测有限，不能定量；而实时荧光定量技术较高通量测序更方便、快捷，且能定量分析靶向种属含量，对DNA拷贝数定量灵敏度高，特异性和可靠性强，易于重复等，故被广泛应用于肠道微生态的研究[10]。肠道清洁是进行结肠镜检查前的必备操作，结肠黏膜附近有残留的肠道清洗液。本研究以肠道清洁后结肠局部残留肠液作为肠道菌群的来源，使用粪便提取试剂盒进行DNA提取。由于肠液菌群较少，本研究适当加大了模板DNA的含量进行扩增，肠黏膜中能检测到的菌群在肠液中均可被检测到。故肠液可作为肠道微生态研究新的标本来源。
前期采用高通量结合荧光定量PCR法的研究显示，腹泻型IBS患者的黏膜菌群与对照患者存在显著差异[11]。本研究显示，腹泻型IBS患者的肠液和结肠黏膜的菌群特点十分相近，均为普氏杆菌、拟杆菌门和梭菌属，都较对照患者减少；两组双歧杆菌、害肺戴阿里斯特杆菌、肠致病性大肠埃希菌、普拉梭菌、厚壁菌门、乳杆菌属、沙门菌等均无差异。结肠黏膜组织与肠液中的厚壁菌门、乳杆菌属、双歧杆菌属、普拉梭菌均呈正相关，证实肠液在一定程度上可反映肠道黏膜菌群的特点；而沙门菌、肠致病性大肠埃希菌均呈负相关，提示肠道清洁可能对沙门菌和大肠埃希菌这样的消化道常见致病菌有一定清除作用。这与腹泻后腹痛缓解可能有一定的相关性。
腹泻型IBS与肠道菌群失调相关，但究竟是哪些菌株的作用，尚无定论[12]。IBS是一个以症状区分的功能性疾病，亚型较多，未发现特异菌株可能与此相关。菌群存在地域差异[13]。在我国，酪酸梭菌治疗腹泻非常有效[14]。本研究显示，腹泻型IBS患者肠液和结肠黏膜中的梭菌属菌群数均减少。梭菌属是厚壁菌门的优势菌属，可能与肠道黏膜的完整性密切相关[15]。酪酸梭菌产生的丁酸盐具有保护黏膜完整、抵御结肠癌的作用，同时酪酸梭菌作为一种益生菌，还能促进双歧杆菌、乳杆菌等益生菌增殖，加强肠道蠕动，减少致病菌的黏附和定植[16]；而拟杆菌门可促进宿主分解多糖，促进肠黏膜的血管再生和免疫系统发育，有助于维持肠道微生态平衡[17]。以往腹泻患者常自行服用抗菌药物治疗，会加重肠道菌群失调，导致症状反复，现多以补充酪酸梭菌作为腹泻型IBS的治疗方式，可能与纠正菌群失调有关。
