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腹泻型肠易激综合征是仅次于上呼吸道感染的第二大常见病，中医药治疗已成为当前研究热点。加味理肠饮治疗本病疗效较好，本文拟通过实验研究探讨其深层治疗机制。
［摘要］目的：观察加味理肠饮对腹泻型肠易激综合征（IBS-D）模型大鼠血浆、结肠组织5-羟色胺（5-HT）与神经肽（NPY）、丘脑及结肠组织5-羟色胺3受体（5-HT3R）mRNA与NPYmRNA表达、结肠肥大细胞（MC）水平的影响，以探讨其作用机制。方法：将SD大鼠随机分为7组，除空白对照组外，各组均予避水应激+夹尾刺激+番泻叶灌胃方法建立IBS-D模型，后分别给予相应药物灌胃，连续用药28d后处死，运用Elisa法检测大鼠血浆及结肠组织中5-HT与NPY水平，并采用PCR法检测丘脑及结肠组织中5-HT3RmRNA、NPYmRNA的表达，采用甲苯胺蓝染色法检测MC的数量。结果：与空白组比较，模型组血浆及结肠组织5-HT的表达均上调、NPY表达下调（P＜0.05），模型组丘脑及结肠组织5-HT3RmRNA的表达均上调、NPYmRNA的表达下调（P＜0.05）；与模型组比较，各药物组的血浆及结肠组织NPY表达均上调、丘脑及结肠组织5-HT3RmRNA表达均下调（均P＜0.05），除中药低剂量组外，其余各药物组的血浆及结肠组织5-HT表达均下调、丘脑及结肠组织NPYmRNA表达均上调（P＜0.05）；与空白组比较，模型组结肠组织MC数增多（P＜0.05）；与模型组比较，各药物组MC均减少（P＜0.05）。结论：加味理肠饮能够有效的治疗IBS-D，其作用机制可能与调节5-HT、NPY、5HT3RmRNA、NPYmRNA的表达以及MC水平有关。
腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是一种没有器质性疾病或生化异常可以解释的腹部不适或疼痛同时伴有排便紊乱的疾病，现已成为全球性胃肠功能性疾病，是仅次于上呼吸道感染的第二大常见病。IBS-D发病机制复杂，几十年来人们不断提出各种各样的假说试图阐明其发病机制及病理生理，但几乎没有一种单一的发病机制能解释所有的IBS临床表现。因此，中医药治疗本病已成为研究热点。在前期的临床及实验研究基础上，课题组进一步研究加味理肠饮对IBS-D患者5-羟色胺（5-HT）、神经肽（NPY）、5-羟色胺3受体（5-HT3R）mRNA与NPYmRNA表达以及肥大细胞（MC）数的影响，以期探讨加味理肠饮治疗IBS-D的深层机制。
1资料与方法
1.1实验动物
出生后42dSPF级SD雄性大鼠70只，体质量（±10）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物合格证号：SCXK（鲁）。
1.2药物
加味理肠饮（炒白术、茯苓、党参、炒白芍、柴胡、香附、陈皮、防风、高良姜、桂枝、炙甘草等）由山医院中药制剂室提供，配制成含生药浓度分别为0.5g/mL、1g/mL、
2g/mL的溶液。匹维溴铵片（得舒特）（法国，批号：）；复方谷氨酰胺肠溶胶囊（谷参肠安胶囊，国药准字：H，成都地奥集团天府药业）。
1.3主要试剂与仪器
5-HT3R、NPYmRNA物质PCR试剂盒，购自上海桑尼生物科技有限公司；TrizolReagent，购自北京康为世纪公司；dNTP（K）、RNA酶抑制剂（10）系上海生工产品；M-MLV逆转录酶（北京Promega公司），2xTaqMasterMix（北京康为世纪公司）。凝胶成像分析系统（美国Alpha），电泳仪（德国Biometro），高速低温离心机（美国ThermoIEC），ND-分光光度计（美国GeneCo-mpany），PCR仪（英国ThermoHybaid），移液器10～μL（法国GLISON）。
1.4实验方法
1.4.1实验分组将SD大鼠随机分为7组：空白对照组（A组），模型对照组（B组），得舒特组（C组），谷参肠安组（D组），加味理肠饮低剂量组（E组），加味理肠饮中剂量组（F组），加味理肠饮高剂量组（G组），每组10只，各组大鼠体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.4.2造模方法将SD大鼠适应性喂养
7d后，予避水应激+夹尾刺激+番泻叶灌胃方法，共持续10d。为消除生物节律影响，造模于每天上午9～11点进行。
1.4.3给药方法C组给予得舒特
15mg/（kg·d）灌胃，D组给予谷参肠安0.2g/（kg·d）灌胃，E组给予加味理肠饮1.5g/（kg·d）灌胃，F组给予加味理肠饮3g/（kg·d）灌胃，G组给予加味理肠饮6g/（kg·d）灌胃，A组和B组分别给予等容积生理盐水灌胃，每天1次，共28d。
1.5标本采集
连续用药28d后，于腹主动脉取血，每只大鼠取5mL，置于抗凝管中，混匀，4℃、r/min低温离心10min，取上清液，-80℃冰箱保存。取血结束后，将大鼠拉颈处死，取大鼠距肛口5cm左右的结肠组织，取出后去除血迹，称质量后加入生理盐水放入匀浆器中研碎，匀浆1～2h后放入低温离心机中r/min离心15min，离心后取其上清液3mL于EP管内，-80℃冰箱保存以备检测。结肠组织取出完毕后，剪开颅骨取出大鼠脑组织，称质量后加入生理盐水匀浆，然后放入低温离心机r/min离心15min，取上清液2mL于EP管内，置于-80℃冰箱内保存。
1.6Elisa法检测大鼠血浆及结肠组织中5-HT与NPY
严格按试剂盒说明书行标准品的稀释→加样→温育→配液→洗涤→加酶→温育→洗涤→显色→终止→测定。
1.7RT-PCR法检测丘脑及结肠组织
5-HT3RmRNA及NPYmRNA表达引物序列：Htr3b：上游CAGACATACGCTTTCCCCT，下游CCGGATGTGTAAGTGGAGG。NPY：上游TGGCCAGATACTACTCCGCT，下游TGGGGGCATTTTCTGTGCTT。采用TRIzol法提取组织总RNA。严格按照RT-PCR试剂盒说明书进行逆转录cDNA，以及荧光定量PCR的扩增。
1.8甲苯胺蓝染色检测MC数量
将包埋好的石蜡块连续切片，每张切片厚5μm，每隔5张取1张。采用甲苯胺蓝染色法对MC染色，在光学显微镜下每张片子随机选取6个视野观察并记录MC数量，取平均值。
2统计学分析
采用SPSS17.0软件统计分析，数据以均数±标准差表示。各组之间的比较采用单因素方差分析，两两比较时，如方差齐采用LSD检验，方差不齐选DunnettT3检验。取α=0.05为检验水准。
3实验结果
3.1加味理肠饮对IBS-D大鼠血浆和结肠组织5-HT表达水平的影响
与A组比较，B组5-HT表达水平均上调（P＜0.05）；与B组相比，除E组外，其余各药物组5-HT表达水平均下调（均P＜0.05）。见表1。
3.2加味理肠饮对IBS-D大鼠血浆及结肠组织NPY表达水平的影响
与A组比较，B组NPY表达水平均下调（P＜0.05）；与B组相比，各药物组NPY表达水平均下调（P＜0.05）。见表2。
3.3加味理肠饮对IBS-D大鼠丘脑及结肠组织5-HT3RmRNA表达水平的影响
与A组对比，B组5-HT3RmRNA表达水平上调（P＜0.05）；与B组相比，各药物组的5-HT3RmRNA表达水平均下调（P＜0.05）。见表3。
3.4加味理肠饮对IBS-D大鼠丘脑及结肠组织NPYmRNA表达水平的影响
与A组对比，B组NPYmRNA的表达水平下调（P＜0.05），与B组对比，除E组外，各药物组NPYmRNA表达水平均上调（P＜0.05）。见表4。
3.5加味理肠饮对IBS-D大鼠结肠组织MC水平的影响
对各组大鼠结肠MC的甲苯胺蓝染色结果发现，与A组（1.34±0.18）比较，B组大鼠的结肠MC（6.25±0.67）显著增多（P＜0.05）；与B组比较，F组结肠MC数（2.44±0.37）明显减少（P＜0.05），且较G组（3.57±0.45）进一步减少（P＜0.05）。见下图。
4讨论
IBS-D严重影响着人们的生活质量，其发病机制尚不完全清楚，其主要生理病理变化包括内脏感觉异常敏感和胃肠动力障碍。有研究发现，5-HT信号系统异常可引起胃肠动力、内脏高敏感性和分泌功能异常，与IBS、功能性消化不良、便秘、腹泻等消化系统疾病关系密切，其中关系最密切的是5-HT3受体及5-HT4受体。目前有关IBS-D病理机制的研究逐渐深入，脑肠轴异常成为本病的一个重要机制及研究方向。脑肠肽是脑肠轴中发挥重要传递作用的递质。研究显示，神经递质NPY在IBS-D脑肠轴异常的发病机制中发挥着重要作用。MC为免疫细胞，活化所释放介质可激起肠神经系统的反应，刺激感觉传入神经通路，诱使内脏痛觉过敏和肠动力失调。多项研究表明，IBS-D患者结肠MC数目明显增多，且MC活化比率明显增高，MC活化的数目与症状严重程度之间呈正相关。对不同分型的IBS-D患者直肠活组织标本研究发现，感染后和非感染后IBS-D的MC均明显增多。本课题选取5-HT、NPY以及MC数作为研究内容，切合目前认为的IBS-D发病机制，并且发现加味理肠饮（尤其是中、高剂量组）能够上调NPY的表达水平、下调5-HT的表达水平、减少MC数（P＜0.05），对进一步研究确认IBS-D的发病机制有深远意义。除此之外，本课题研究5-HT3RmRNA及NPYmRNA，发现加味理肠饮（尤其是中、高剂量组）能够上调NPYmRNA的表达水平、下调5-HT3RmRNA的表达水平（P＜0.05），从基因调控水平研究中医药治疗IBS-D的机制，具有较大的价值。
到目前为止，现代医学治疗IBS-D主要以对症、抗焦虑或抑郁以及心理辅导等为主，疗效有限。有些设计严格的临床试验或系统评价证明中医药对IBS-D有很好疗效。中药汤剂的有效成分由于组方的不同、药物的差异繁复多变，其起效途径也是多方面、多靶点的，其中对胃肠的调整机制可能是通过调控一些胃肠道激素，使之内脏高敏逐步恢复正常，并调整胃肠道的分泌和运动，从而缓解腹痛、腹泻等临床症状。
加味理肠饮能调节IBS-D多种脑肠肽的分泌紊乱状态，从而通过神经-内分泌系统调节胃肠道运动、感觉和分泌功能，改善IBS-D患者的腹痛或腹部不适、腹泻等症状。本研究发现，中、高剂量加味理肠饮具有治疗IBS-D的作用，临床应用加味理肠饮治疗IBS-D疗效显著。加味理肠饮由柴胡桂枝汤、痛泻要方、四君子汤三方加减化裁而来。柴胡桂枝汤是《伤寒论》治疗太阳少阳并病的方剂，而在《金匮要略》中主治心腹卒中痛者，隗继武教授通过临床实践，应用本方治疗IBS-D临床效果显著；痛泻要方被广泛应用于各种证型IBS-D的治疗；四君子汤历来被认为是健脾补气第一方，用于治疗各种脾胃气虚证。本研究首次提出在中医“和法”的指导下研究中药复方治疗IBS-D的疗效和机制。纵观全方健脾为主佐以疏肝，行气散寒又佐以解郁清热，切合病机，清补结合、寒热并用、营卫同调、兼顾心肝脾是本方的四大特点，切合中医“和法”理论。
本课题的研究内容尚未深入到蛋白水平，后续将进一步从蛋白水平研究加味理肠饮治疗IBS-D的作用机制。
编者按：该文刊载于《山东中医药大学学报》年第4期，完整原文见链接。
责任编辑：李庆升
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